Für Larry heißt es Abschied nehmen. Nach der ereignisreichen Museumsnacht des ersten Films werden alle Exponate durch supermoderne Hologramme ersetzt. Die Originale befinden sich bereits auf dem Weg zum Smithsonian in Washington - und das ist nicht weniger als das größte Museum der Welt. Doch die wohlverdiente Ruhe ist von nur kurzer Dauer. Nach 24 Stunden erhält Larry den Anruf eines wohlbekannten Miniatur-Cowboys, der eigentlich zu den Ausstellungsstücken gehört. Und sich schon wieder äußerst lebendig anhört: Es ist Jedadiah, der dringend Hilfe braucht. Versehentlich wurde nämlich die Tafel von Ahkmenrah nach Washington geschickt, durch deren Kräfte schon im ersten Teil alle Figuren zum Leben erweckt wurden. Das Smithsonian steht Kopf, denn natürlich kann man von historischen Persönlichkeiten wie Cowboys und Indianern, dem Neandertaler und George Washington und vielen anderen nicht erwarten, dass sie sich sonderlich gut verstehen. Hals über Kopf reist Larry ins Museum, um den bösen Pharao Kahmunrah, den Mafia-Paten Al Capone, Napoleon und Ivan den Schrecklichen zu stoppen.
Doch zum Glück ist er nicht auf sich allein gestellt - Präsident Teddy Roosevelt und die temperamentvolle Flieger-Pionierin Amelia Earhart tun ihr bestes, um mit Larry gegen das Chaos vorzugehen...
"Nachts im Museum 2" ist der erste Film, der im weltgrößten Museumsarchiv Smithsonian, Washington, gedreht wurde. Hier sind mehr als 136 Millionen Exponate ausgestellt.
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